Насморк

Параметры определения группы крови. Определение групп крови стандартными сыворотками Определение группы крови по сывороткам

Существует два метода: по стандартным сывороткам (прямая реакция) и стандартным эритроцитам (обратная реакция).

Определение группы крови по стандартным сывороткам

Для определения группы крови по этой методике определяемую кровь смешивают с сывороткой уже известных групп и по наличию или отсутствию агглютинации судят о группе крови. Для определения применяют заранее приготовленные «стандартные сыворотки» крови О (I), А(II), В (III) двух разных серий для каждой группы. На предметное стекло или фарфоровую тарелку наносят по 2 капли стандартных сывороток (предварительно карандашом на стекле отмечают группу сыворотки) попарно из каждой серии.

Сыворотки обязательно берут разными пипетками. Палец исследуемого больного обрабатывают спиртом и производят укол специальной иглой-скарификатором. Берут 6 капель крови (не более булавочной головки каждая) и помещают их рядом на тарелку со стандартными сыворотками. Отдельными стеклянными палочками перемешивают кровь и сыворотки. Через 5 мин к сывороткам добавляют по 1 капле физиологического раствора (для исключения ложной агглютинации).

Результаты исследования:

если агглютинация отсутствует во всех трех парных каплях, то исследуемая кровь принадлежит к первой группе крови О (I);

отсутствие агглютинации с сыворотками О (I) и В(П) говорят о том, что группа крови А (II);

при отсутствии агглютинации с сывороткой группы крови В (III) и при агглютинации с сыворотками О (I) и А (II) следует считать, что группа крови В (III);

агглютинация со всеми тремя сыворотками обозначает принадлежность крови к четвертой группе — АВ (IV).

Определение группы крови по стандартным сывороткам из двух серий производят во избежание ошибок. При агглютинации с тремя сыворотками — AB (IV) группа крови — необходимо провести дополнительное определение с сывороткой AB (IV) группы крови, которая хранится в специальной запаянной ампуле.

В сомнительных случаях исследование повторяют с другими сериями сывороток или производят определение при помощи стандартных эритроцитов.

Определение группы крови по стандартным эритроцитам

На фарфоровую тарелку наносят 3 капли сыворотки, приготовленной из крови реципиента. К сывороткам добавляют по булавочной головке стандартных эритроцитов О (I), А (II) и В (III). Через 5 мин добавляют по одной капле физиологического раствора.

Результаты исследования:

при отрицательной реакции со стандартными эритроцитами О (I) и положительной со стандартными эритроцитами А (II) и В (III) — группа крови первая;
при отсутствии реакции агглютинации со стандартными эритроцитами О (I) и А (II) и положительной с эритроцитами В (III) группа крови вторая;
при отсутствии реакции агглютинации со стандартными эритроцитами О (I) и В (III) и положительной с эритроцитами А (II) группа крови третья;
при отсутствия реакции агглютинации со всеми стандартными эритроцитами группа крови четвертая.

«Хирургические болезни», С.Н.Муратов

Процедура определения групп крови по системе АВО заключается в выявлении антигенов А и В в эритроцитах с помощью стандартных антител и использованием агглютининов в плазме или сыворотке анализируемой крови стандартными эритроцитами. Методика разработана в начале XX века и до сих пор активно применяется в медицине. Определение антигенов А и В осуществляется благодаря цоликлонам анти-А и анти-В.

Основные понятия

У доноров всегда определяются не только антигены в эритроцитах, но и агглютинины в сыворотке (плазме) с применением стандартных эритроцитов. В качестве биоматериала используется венозная кровь. Перед исследованием необходимо отказаться от жирной пищи за сутки до анализа и не курить за полчаса до сдачи теста. Группы крови определяют дважды: сначала в лечебном отделении, где заготавливается материал, а затем подтверждают исследованием в лаборатории.

Определение групп крови по системе АВО является основным тестом, который используется в трансфузиологии. Также подобная система групп крови есть у некоторых животных, например у шимпанзе, горилл и бонобо.

История открытия

В науке существует общепринятое мнение о том, что методика определения групп крови по системе АВО была выявлена впервые Карлом Ландштейнером, австрийским учёным, в 1900 году. Тогда он описал в своём труде три типа антигенов. За это через тридцать лет ему была присуждена Нобелевская премия по медицине и физиологии. Из-за того, что между учёными раньше не было тесных связей, позже установили, что чешский врач-серолог Ян Янский независимо от изысканий К. Ландштейнера впервые описал четыре группы крови человека, но его исследования были не известны широкой аудитории. В настоящее время именно классификация, разработанная Я. Янским, применяется в России и республиках бывшего СССР. В США У. Л. Мосс создал свою похожую работу в 1910 г.

Методика определения групп крови по системе АВО с помощью цоликлонов

Группа крови должна определяться в помещении с хорошим освещением с соблюдением диапазона температуры от 15 до 25 градусов Цельсия, так как отклонения от этой нормы могут повлиять на результаты исследования. На пластинке или тарелке пишутся инициалы и фамилия пациента. Слева направо или по кругу наносят стандартные обозначения групп (О(I), A(II), В(III)). Под ними размещают по капле соответствующие сыворотки отдельными пипетками для каждого вида. Затем к ним добавляется кровь пациента. Материал для исследования берется из мочки уха или пальца. Этого требует техника определения группы крови по системе АВО.

Правомерно также использование эритроцитов, находящихся в пробирке после того, как образовался сгусток. Нужно, чтобы количество сыворотки было больше количества добавленной крови в десять раз. После этого капли перемешиваются стеклянными палочками (отдельно для каждой). В течение пяти минут, аккуратно покачивая пластинку, смотрят за появлением реакции гемагглютинации. Она обнаруживается в том, что появляются маленькие красные комочки, сливающиеся затем в более крупные. Сыворотка в это время практически полностью теряет цвет.

Для того чтобы устранить ложную гемагглютинацию простого склеивания эритроцитов, нужно через три минуты добавить одну каплю физиологического раствора и проверить, сохраняется ли агглютинация. Если да, то она является истинной. Все, определение групп крови по системе АВО на этом завершено.

Толкование результатов

В результате могут наблюдаться четыре реакции:

не происходит агглютинация ни с одной из сывороток - первая группа О(I);
реакция проявилась с сыворотками I(ab) и III(a) - вторая группа А(II);
агглютинация наступает с сыворотками I(ab) и II(b) - третья группа В(III);
если реакция происходит с тремя сыворотками, нужно провести дополнительную процедуру с реактивами группы АВ(IV), которые являются стандартными; если агглютинация в такой капле отсутствует, можно считать, что это 4-я группа крови АВ(IV).

Экспресс-метод для резус-фактора

Методика определения групп крови по системе АВО предполагает одновременное выявление резус-фактора (Rh).

Поверхность пластинки предварительно смачивают и пишут на ней «контрольная сыворотка» и «сыворотка антирезус». Затем под надписями располагают одну-две капли нужных реактивов и добавляют к ним анализируемый материал. Для этого также можно использовать кровь из пальца (в таком же количестве, как и объём сыворотки) или эритроциты, оставшиеся на дне пробирки после появления сгустка (половина объёма сыворотки). Выбор материала на конечный результат не влияет. Затем кровь и сыворотка перемешиваются сухой стеклянной палочкой, после чего в течение пяти минут ожидают наступления реакции. Для того чтобы устранить ложные показания, через три-четыре минуты добавляют изотонический раствор натрия хлорида (всего несколько капель). Определение группы крови по системе АВО и Rh проводится очень часто.

Если агглютинация эритроцитов в капле с сывороткой происходит, это указывает на положительный резус крови. По статистике Rh+ встречается у 85 % населения планеты. Отсутствие её позволяет говорить о резус-отрицательной принадлежности. Если агглютинация появилась в контрольной сыворотке, значит она пришла в негодность. К сожалению, алгоритм определения группы крови по системе АВО не всегда срабатывает идеально.

Какие ошибки могут быть допущены при данной методике?

Неточности при определении принадлежности крови той или иной группе зависят от следующих причин:

Технических.
Биологической специфики исследуемой крови.
Неполноценного характера стандартных сывороток и эритроцитов.

Технические ошибки

Возможные погрешности при определении группы крови системы АВО перекрестным способом:

Ошибки биологической специфики

Погрешности, связанные с биологической спецификой анализируемой крови, делятся на два типа.

Зависящие от особенностей эритроцитов.
Ошибки, обусловленные биологическими особенностями сыворотки.

Рассмотрим каждый вид более подробно.

Зависящие от особенностей эритроцитов

Поздняя агглютинация, объясняющаяся «слабыми» формами эритроцитов и антигенов. Для того чтобы избежать ошибок, определять группу крови доноров и реципиентов нужно с использованием стандартных эритроцитов. Индентифицировать агглютиноген А 2 следует повторным исследованием с другими видами реагентов и другой посуды, увеличив время регистрации реакции.
«Панагглютинация» («аутоагглютинация») - умение крови проявлять одинаковую реакцию неспецифического характера со всеми сыворотками, в том числе с собственной. Через пять минут острота такой агглютинации слабеет, хотя должна усиливаться. Подобные случаи наблюдаются у онкобольных, обожжённых и др. В качестве контроля необходимо оценить проявление агглютинации анализируемых эритроцитов в стандартной сыворотке четвёртой группы и физрастворе. При «панагглютинации» группу крови определяют в результате тройного отмывания эритроцитов. Если оно не даёт нужного результата, стоит произвести повторный забор образца крови в согретую перед процедурой пробирку и поставить пробу в термоконтейнер, чтобы способствовать поддержанию температуры 37 градусов Цельсия и выше. Затем следует доставить в лабораторию, где сохраняется указанная выше температура и используются подогретые физиологический раствор, пластинка и реактивы.

Иногда эритроциты анализируемой крови располагаются как «монетные столбики», и их можно принять за агглютинаты. Если добавить две капли изотонического раствора и мягко покачать планшет, красные кровяные клетки занимают правильную позицию.
Неполная или смешанная агглютинация, встречающаяся у пациентов со второй, третьей и четвёртой группами в результате трансплантации костного мозга или в первые три месяца после переливания крови 0(I).

Обусловленные биологическими особенностями сыворотки

Ошибки, связанные с применением неполноценных стандартных эритроцитов и сывороток

Слабые сыворотки с прошедшим сроком годности или имеющие титр меньше 1:32 способны зарождать слабую и позднюю агглютинацию. Применение таких реактивов недопустимо.

Использование негодных стандартных эритроцитов или сывороток, приготовленных в нестерильных условиях и законсервированных в недостаточной степени, приводит к появлению «бактериальной» агглютинации, имеющей неспецифическую природу.

Существует множество популярных предположений о группах крови системы АВО, появившихся непосредственно после её обнаружения в разных мировых культурах. Так, например, в 30-е годы прошлого столетия в Японии и некоторых других странах получила популярность теория, связывающая группу крови с тем или иным типом личности. Подобные теории популярны и на сегодняшний день.

Есть также мнение, что человек, имеющий группу А, подвержен тяжёлому похмелью, О связана с хорошими зубами, а группа А2 - с самым высоким уровнем IQ. Но научно такие утверждения не доказаны.

Мы рассмотрели определение групп крови по системе АВО с помощью стандартных сывороток.

Определение группы крови по стандартным сывороткам используется часто (по сравнению с другими методиками). В основе данной техники — содержащиеся в крови агглютинины и агглютиногены в различных комбинациях.

Соединение одноименных агглютиногена и агглютинина сопровождается реакцией агглютинации (однородное пятно распадается на многочисленные мелкие пятна, состоящие из эритроцитов, склеившихся между собой).

Суть метода

При оказании медицинской помощи не всегда удается быстро остановить кровотечение, для переливания требуется определение группы крови, резус-фактора.

Существуют 2 эритроцитных антигена (агглютиногены А и В) и 2 антитела (а и b). Различные комбинации антигенов и антител образуют 4 группы крови.

Данный способ имеет преимущества, т. к. позволяет свести к одному многочисленные измерения.

Методика определения показателей

Определение групп крови по стандартным сывороткам проводится с использованием реактивов, содержащих агглютинины разных групп, вступающих в реакцию с агглютиногенами, находящимися на поверхности эритроцитов.

Чтобы выявить группу крови, достаточно воспользоваться стандартными сыворотками лишь II и III групп. Однако для исключения возможных ошибок с целью дополнительного контроля используют и остальные (I и IV групп).

Изготовление сыворотки

Стандартные сыворотки для определения группы крови получают из донорской крови. С этой целью используют специальную систему: выделяют плазму вместе с находящимися в ней антителами, затем ее разводят изотоническим раствором хлорида натрия.

Помещают 1 мл раствора NaCl 0,9% в пробирку, добавляют плазму (1 мл), взбалтывают состав. Берут 1 мл полученной смеси, переносят в другую пробирку с изотоническим раствором.

Манипуляцию повторяют, пока не получат разведение смеси в пропорции 1:256. Другие разведения не используют, чтобы исключить возникновение ошибки.

Для одного исследования группы крови с помощью стандартных сывороток их требуется 3 (2 серий для каждой группы), отличающихся по цвету:

I (0) — прозрачная жидкость, флакон снабжен белой этикеткой;
II (А) — жидкость голубая, флакон с 2 полосами синего цвета;
III (В) — бледно-розовая жидкость, флакон с 3 розовыми полосками;
IV(АВ) — желтая жидкость, на этикетке флакона 4 желтые полоски.

На этикетках указаны:

титр;
срок годности;
дата выпуска;
серийный номер.
данные об изготовителе.

Проведение исследования

Температура в помещении должна быть в пределах +15…+ 25°С, требуется хорошее освещение.

Используют специальный планшет, имеющий области с пометками. На него наносят каждую сыворотку (берут 2 образца, 1 из них — контрольный, 2 — для диагностики).

Затем рядом с каждой каплей сыворотки размещают каплю крови, смешивая с каждым в отдельности реагирующим раствором. Спустя несколько минут (5-6) анализируют полученные данные:

если происходит реакция агглютинации — сывороточный тест считается положительным;
при отсутствии агглютинации тест отрицательный.

Результаты исследования

В случае положительного результата эритроциты склеиваются (в реагирующем растворе образуются красные сгустки).

Если цвет раствора не изменился, реакция считается отрицательной. Есть закономерности, зависящие от комбинаций отрицательных и положительных реакций, происходящих в растворах:

I(0), если ни в одном образце нет положительной реакции;
II (А), если в образце II (А) состояние не изменилось, а в 2 остальных оказалась положительная реакция;
III(В), если только в образце III(В) реакция оказалась отрицательной;
IV(АВ), если в каждом из 3 образцов реакция оказалась положительной.

Появление других комбинаций связано с погрешностями, возникающими при исследовании.

Использование старых реактивов или неправильное проведение анализа может сопровождаться слабой реакцией. В таких случаях с целью уточнения необходимо сделать тесты с использованием других методик.

Как происходит определение группы крови по стандартным сывороткам? Наверное, наблюдая за действиями лаборанта и за происходящей на специальной планшетке химической реакцией, подобный вопрос задавали себе многие. Ничего загадочного в этом процессе нет, а механизм установления групповой принадлежности основан на реакции агглютинации, которая происходит при взаимодействии компонентов крови агглютиногенов и элементов сыворотки.

Основные характеристики групп

Определение группы по стандартным сывороткам основано на том, что в крови человека содержатся, в различных комбинациях агглютиногены (А и В) и агглютинины (a и b). При встрече одноименных агглютинина и агглютиногена происходит быстрая агглютинация, а на планшетке этот процесс будет выглядеть как распадание однородного кровяного пятна на множество мелких пятнышек.

Для определения группы крови используются сыворотки, содержащие агглютинины различных групп, которые вступают в реакцию с содержащимися на поверхности эритроцитов агглютиногенами:

0 (I) - содержит только агглютинины a и b;
A (II) - имеется антиген А и агглютинин b;
В (III) - есть агглютиноген B и антитело а;
АВ (IV) - в сыворотке нет антител, а на поверхности эритроцита располагается агглютеногенный комплекс АВ.

Тип крови с помощью стандартных сывороточных растворов определяется в течение 5-10 минут и не требует дополнительной подготовки пациента к исследованию. Этим способом можно исследовать как венозную, так и периферическую кровь, получая одинаковый результат.

В экстренных случаях (подготовка к срочной операции или необходимость немедленного восполнения кровопотери) проводят смешивание, капая кровь из прокола на пальце больного прямо на планшетку с налитыми на нее стандартными сыворотками.

Техника проведения анализа

Для исследования применяется плоская планшетка с углублениями в ней. Углубления расположены по 3 в ряд (имеется 2 ряда) и имеется одно внизу.

Над каждой парой углублений для удобства лаборанта написано I, II или III и для нанесения в ячейки соответствующих стандартных сывороток.

Анализ проводится так:

В первом ряду в соответствующие ячейки наливается несколько капель сывороточного раствора I, II и III вида (в соответствии с наименованием углубления).
Во второй ряд дублируются аналогичные растворы, но другой серии изготовления (необходимый контроль для избегания ложной агглютинации из-за некачественной сыворотки).
В растворы стеклянной палочкой добавляются по капле венозной или периферической крови.
Перемешивание, чтобы избежать случайного повреждения эритроцитов, производится плавным покачиванием планшетки.
Далее материал оставляется на 5 минут, после чего проводится оценка полученного результата.

Оценивается вид и структура жидкостей по типу раствора, также проверяется соответствие с аналогичным раствором в рядом расположенной ячейке.

Если, к примеру, в одном углублении с цифрой II произошла агглютинация, а в другом с аналогичным реактивом нет, то определение группы крови с помощью сывороточных составов считается неверным. Его необходимо повторить, используя сыворотки 2 других серий.

Оценка результатов

Тип крови стандартными сывороточными реактивами определяется на основании видимой реакции агглютинации, и результат может быть следующим:

I - основные и контрольные капли на лабораторной тарелочке остались без изменений.
II - химическая реакция произошла в ячейках I и III.
III - наблюдается агглютинация в углублении I и II.
IV - имеются изменения во всех емкостях лабораторной тарелочки.

При определении IV типа всегда проводится контроль с сывороткой IV, чтобы предотвратить ложноположительный результат. В контрольном смешивании по истечении 5 минут не должно произойти никаких изменений.

Методом определения типа крови при помощи стандартных сывороточных реактивов пользуются почти во всех лабораториях. Быстрый и доступный способ позволяет в течение нескольких минут определит группу.

Полученные данные учитываются только в том случае, когда агглютинация ярко выражена. Слабая химическая реакция может быть из-за старых реактивов или из-за неправильного проведения анализа. Результат не может считаться достоверным. В сомнительных случаях, помимо исследования стандартными сывороточными составами, могут быть сделаны для уточнения группы тесты с цоликлонами или «эритротест».

С помощью стандартных сывороточных составов определение группы возможно за несколько минут. Метод очень прост и не требует от лаборанта специальных навыков.

Способ наиболее часто используют в серологических лабораториях. Суть метода состоит в определении наличия или отсутствия в исследуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, а также групповых антител α и β с помощью стандартных эритроцитов. Реакцию со стандартными сыворотками проводят описанным выше способом.

Реакцию со стандартными эритроцитами проводят следующим образом.

Необходимое оснащение

Оснащение для реакции со стандартными эритроцитами отличается тем, что для её проведения необходимы стандартные эритроциты трёх групп крови: 0(I), А(II), B(III). Стандартные эритроциты приготавливают из крови доноров с заранее известной группой крови, хранят при 4-8 °С. Срок годности 2-3 дня.

Методика проведения реакции

1. Кровь для исследования берут из вены в сухую пробирку, центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 мин для получения сыворотки.

2. На маркированную тарелку пипеткой наносят три больших капли (0,1 мл) сыворотки исследуемой крови из пробирки, а рядом с ними - по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп.

3. Дальнейшие мероприятия проводят аналогично методу с использованием стандартных изогемагглютинирующих сывороток: соответствующие капли смешивают стеклянными палочками, планшет покачивают, наблюдают в течение 5 мин, в капли с агглютинацией добавляют изотонический раствор хлорида натрия, после чего оценивают результат.

Таблица 6-3. Оценка результатов определения группы крови перекрёстным способом

Трактовка результатов

Оценивают данные, полученные при обеих реакциях (со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами - табл. 6-3).

Особенность трактовки результатов реакции со стандартными эритроцитами - эритроциты группы 0(I) считают контрольными (в них нет антигенов, что делает принципиально невозможной специфическую реакцию агглютинации с любой сывороткой).

Результат перекрёстного способа считают достоверным, только если при оценке результатов реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами ответы о группе исследуемой крови совпадают. Если этого не происходит, обе реакции следует переделать.

Определение групп крови моноклональными антителами

Необходимое оснащение

Для определения группы крови используют моноклональные антитела, для получения которых применяют гибридомную биотехнологию.

Гибридома - клеточный гибрид, образованный путём слияния клетки опухоли костного мозга (миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим специфические моноклональные антитела. Гибридома приобретает свойства обоих «родителей»: способность к неограниченному росту, характерную для опухолевой клетки, и возможность синтезировать антитела, присущую иммунному лимфоциту.

Таблица 6-4. Схема оценки результатов определения групп крови с помощью моноклональных антител (цоликлоны анти-А и анти-В)

Разработаны стандартные реагенты - моноклональные антитела: цоликлоны анти-А и анти-В, применяемые для определения агглютиногенов эритроцитов.

Цоликлоны используют в виде лиофилизированного порошка красного (анти-А) или синего (анти-В) цвета, порошок разводят изотоническим раствором натрия хлорида непосредственно перед исследованием.

Техника проведения реакции

Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с ними наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) исследуемой крови. После перемешивания составных частей за реакцией агглютинации наблюдают в течение 2-3 мин.

Трактовка результатов

Оценка результатов очень проста (табл. 6-4).

Методика определения группы крови с помощью цоликлонов позволяет отказаться от стандартных изогемагглютинирующих сывороток, получаемых из донорской крови.